Impuretés dans les peptides: ce que l’HPLC et la spectrométrie de masse peuvent réellement détecter
Impuretés dans les peptides: on a expliqué séparément ce que font l’HPLC et la spectrométrie de masse. Voici maintenant ce qu’elles cherchent concrètement à détecter, et surtout ce qui peut leur échapper.
Impuretés dans les peptide: celles liées à la synthèse
Pendant la synthèse peptidique en phase solide, chaque étape d’ajout d’un acide aminé doit être complète avant de passer à la suivante. Quand une étape de couplage ou de déprotection est incomplète, ça produit des séquences de délétion: des chaînes auxquelles il manque un ou plusieurs acides aminés. La présence d’impuretés dans les acides aminés de départ ou l’élimination incomplète d’un excès de réactif avant le cycle suivant peut produire l’effet inverse: des séquences d’insertion contenant un acide aminé supplémentaire.
L’épimérisation peut aussi survenir pendant la synthèse, notamment lors de l’activation ou du couplage. Elle inverse la configuration d’un centre chiral, par exemple lorsqu’un résidu attendu sous forme L se retrouve sous forme D. Le peptide obtenu devient alors un diastéréoisomère du peptide ciblé, tout en conservant la même formule chimique et la même masse exacte.
Un test colorimétrique couramment utilisé en laboratoire (le test de Kaiser) sert à suivre les étapes de couplage et de déprotection, mais il n’est pas toujours assez sensible pour garantir une complétion totale, surtout sur des séquences particulièrement difficiles à synthétiser.
Les produits de dégradation
Même un peptide correctement synthétisé peut se dégrader par la suite, par des mécanismes chimiques distincts de la synthèse elle-même.
La méthionine peut s’oxyder, spontanément ou en présence de traces de métaux comme le fer ou le cuivre, formant d’abord un sulfoxyde puis, potentiellement, une sulfone. La désamidation touche l’asparagine et la glutamine, produisant un mélange de formes légèrement différentes de la molécule.
Ce que l’HPLC peut séparer
Certaines impuretés possèdent des propriétés suffisamment différentes pour apparaître comme des pics distincts. Leur détection dépend toutefois de la colonne, du gradient, du détecteur, de la longueur d’onde et de la résolution de la méthode. Une impureté peut co-éluer avec le peptide principal ou répondre faiblement au détecteur et ainsi être sous-estimée.
Ce que la spectrométrie de masse peut identifier
La spectrométrie de masse mesure le rapport masse-charge des ions observés et permet de vérifier si la masse obtenue correspond à la masse théorique attendue. Cette concordance soutient l’identification du peptide, mais ne prouve pas à elle seule que toute sa structure est correcte.
À retenir: une mesure standard de la masse moléculaire intacte ne permet pas de distinguer un peptide de son épimère, puisqu’ils possèdent la même masse exacte. Leur différenciation peut nécessiter une séparation chromatographique adéquate, un standard de référence chiral ou des techniques de spectrométrie de masse spécialisées.
Ce qu’il faut savoir sur la quantité, la stérilité et les endotoxines
Un pourcentage de pureté obtenu par HPLC ne confirme pas automatiquement la quantité totale de peptide dans le flacon. Cette quantité peut toutefois être mesurée au moyen d’une méthode quantitative validée, par exemple un dosage HPLC étalonné avec un standard de référence qualifié. Des méthodes LC-MS quantitatives peuvent également être utilisées lorsqu’elles sont correctement étalonnées et validées.
La stérilité, les endotoxines, l’eau, les solvants résiduels et les contaminants inorganiques nécessitent quant à eux des analyses distinctes, qui ne font pas partie d’une analyse HPLC ou MS standard.
The Bottom Line
Les impuretés peptidiques peuvent provenir des matières premières, d’erreurs survenues pendant la synthèse — comme les délétions, insertions et épimérisations — ou d’une dégradation subséquente, notamment par oxydation ou désamidation. L’HPLC et la LC-MS peuvent révéler plusieurs de ces problèmes, mais leur capacité dépend de la méthode employée. Une simple mesure de masse intacte ne différencie pas un peptide de son épimère, tandis qu’un pourcentage d’aire HPLC ne détermine pas automatiquement la quantité de peptide dans le flacon. La stérilité, les endotoxines, l’eau, les solvants résiduels et les contaminants inorganiques nécessitent également des analyses distinctes.
Sources
- Related impurities in peptide medicines. D’Hondt, M., et al. ScienceDirect / Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0731708514003008
- Eggen, I., Gregg, B., Rode, H., Swietlow, A., Verlander, M., et Szajek, A. Y. (2014). Control Strategies for Synthetic Therapeutic Peptide APIs, Part III: Manufacturing Process Considerations. Article du Therapeutic Peptides Expert Panel de l’USP, publié dans Pharmaceutical Technology. https://www.polypeptide.com/wp-content/uploads/2019/10/1401700851538c41f34cef2.pdf
- McCarthy, D. et al. (2023). Reference Standards to Support Quality of Synthetic Peptide Therapeutics. Pharmaceutical Research, 40(6), 1317-1328. https://doi.org/10.1007/s11095-023-03493-1
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